Интерферонның түрлері және оларды алу жолдары
Интерферон 1957ж. ашылды. Интерферондардың 3 тобы белгілі: α-интерферондар (α-И), вирустардың лейкоциттерге әсері кезінде түзіледі; β-интерферондар (β-И) вирустардың фибробластқа әсері кезінде пайда болады; γ-интерферондары Т-лимфоциттердің бактериальды және вирусты антигендерге әсеріне жауап ретінде немесе жоғарғы беттегі детерминантты лимфоциттерге қарсы анти сарысулармен продуцирленеді. Анығырақ айтсақ, α-интерферон лейкоциттерде вирустарға қарсы түзіледі; β-интерферон фибробластарға вирустар әсер еткенде түзіледі және имммундық деп аталады; γ-интерферондары Т-лимфоциттерде вирустық немесе бактериялық антигендерге және қатерлі ісіктерге қарсы синтезделеді.
Лейкоцидтік α-интерферон алғаш рет 1980 ж. «Биоген» компониясының зерттеушілері Гилберт пен Вейссман және фин ғалымы Кантелл генетикалық құрастырылған ішек таяқшасы бактериясынан алды.
Лейкоциттік интерферонның генін алу үшін Сендай вирусымен жұқтырылған лейкоцит клеткаларынан иРНК фракциясын бөледі. Ревертаза арқылы синтезделген ктДНҚ ұшына олиго – d Г жалғайды, ал рестриктаза Pst 1 арқылы үлкен pBR 322 плазмидасының ұшына олиго dЦ жалғайды. Pst 1 бойынша өтеді. Лейкоциттік α-интерферонның геномында нитрон бөліктері жоқ және деглюкозаланбаған (сахар қалдықтары жоқ). Осыған байланысты α-интерферонның рекомбинанты генінің экспрессиясын E.Coli клеткасында іске асыру қиын емес. Ал, геннің өзін кері-транскрипция арқылы синтездеу өте күрделі, өйткені интерферон иРНҚ-сының мөлшері типті лейкоциттердің өзінде жеткіліксіз. 1982 жылы М.Н.Колосов тобы адамның α-интерферонның синтетикалық генінің синтездеп, оған бактериялық реттеуші элементтерін (промоторды, Lac – оперонның операторын, SD – тізбегін) жалғау арқылы геннің E.Coli клеткасындағы экспрессиясын бақылады.
АҚШ, Жапония, ГФР, Швейцария, Ресей, Франция мен Англияда E.Coli негізінде алынған ген-инженерлік интерферон барлық түрлерін өндірістік деңгейде шығару үшін қазір оларды соңғы клиникалық тексеруден өткізуде. Интерферон өндіру үшін – ішек таяқшасынан басқа Methylomanus, Salmonella, Preudomonas т.б. грам-теріс бактериялар пайдаланылады. Фибробластық β-интерферон геномында да нитрондар жоқ. Бірақ олар γ-интерферондар сияқты глюкозаланған белок болып саналады. Сондықтан β және γ- интерферондарды E.Coli клеткасынан алу азда болса кемшілігі бар. Алайда, бұл кемшіліктерді ген инженериясының әдістерін пайдаланып, жоққа шығаруға болады. Алдыменен 1981 ж. Вашингтон университетінің генетиктері Аммерер және Холл «Генентек» зерттеушілерімен бірігіп, лейкоциттік интерферонды генетикалық құрастырылған ашытқы клеткасында синтездеді. Бактериялық клеткамен салыстырғанда ашытқы клеткасында синтезделген интерферонның мөлшері 10 есе көп болды. Бұдан кейін β және γ- интерферондарды ашытқы клеткаларында синтездеу іске асты. АҚШ-тың «Цетус» Биотехнологиялық фирмасы рекомбинантты β-интерферонды сүтқоректілер клеткалар культурасында синтездеу жұмысын іске асыра алды. Мұнда эукариоттық клеткада – глюкозалау өткендіктен интерферонның синтезделуі 300-500 есе көбейді. Адамның γ- интерферонының гені 12-хромосомада орналасқан және 3 нитрон мен 4 экзоннан құралған.Осыған қарамастан, 1982 ж. Жапон «Сантори» компаниясының зерттеушілері γ- интерферонның рекомбинантты генінің клонын E.Coli клеткасында көбейте алды. Адам интерферондарын алу үшін генді инженерлік технологияны қолдану біршама қиындықтармен қатар жүреді. Біріншіден, әртүлі ақуыздарды кодтайтын мРНК қоспасында кодтайтын интерферон құрамы өте аз, шамамен барлығы 0,1% .
Сурет 1- E.Coli-дағы адам интерферонының синтезіне рекомбинантты плазмиданың сызба-нұсқасы
Анықталғандай интерферондар алдымен жасушада құрамында белгі ретінде соңында М бар полипептидтік тізбектен тұратын сабақтасқан түрінде синтезделеді, нәтижесінде бүтін биологиялық белсенділікке ие, жетілген интерферон түзіледі. Жетілген ақуыз түзетін белгі беретін пептидті ыдыратуға қабілетті ферменттері бактерия құрамында болмайды. Сондықтан бактериялар жетілген интерферон синтездеу үшін, плазмаға тек оны кодтайтын бөлігіндегі генді енгізіп, геннің бір бөлігін алып тастау керек, өйткені, ол белгі беретін пептидті кодтайды. Берілген процедура келесідей түрде жүзеге асырыладын. Интерферон геннің құрамында Sau 3Al рестриктазамен ыдырайтын 3 бөлігі бар, олардың біреуі белгі беретін бөлігінің қасында орналасады. Геннің осы ферментпен толық емес ыдыратуы геннің үзіндісін бөліп алуға мүмкіндік береді. Ол бірінші, цистеинсіз жетілген интерферонды кодтайтын реттіліктегі нуклеотидтерден құралады. Цистеинді кодтайтын триплет АТG белгі беретін бөлікпен бірге ферментпен ыдырайды. Бүтін геннің полинуклеотидтер реттілігінде тотықсыздану үшін құрамында берілген триплет. Сондай-ақ оған жалғастырылған ақуыз синтезінің инициация нүктесі – ATG триплеттен тұратын үлкен емес. ДНК үзіндісі химиялық жолмен синтезделген болатын. Бұл үзіндіні жетілген геннің оқшауланған бөлігіне жалғастырылады және жетілген интерферонның бүтін гені орнатылған болатын. Құрастырылған генді плазмаға мынадай түрде енгізеді, яғни, нРНК синтезінің басталуын қамтамасыз ететін ДНК промотор бөлігінің E.coli экстрактілері мынадай плазмадан тұрады, олар қарсы вирустық белсенділікке ие болады.