ДНҚ репликациясының қазіргі деңгейдегі молекулалық механизмдері.
Дәріс жоспары:
1. Репликация жайлы түсінік.
2. Репликацияның негізгі принциптері.
3. ДНҚ-ң үзілмелі синтезі.
4. Эукариоттарда репликация инициациясы.
Лекция мәтіні:
Репликация дегеніміз ДНҚ молекуласының екі еселенуі. Уотсон мен Криктің моделі екі еселену принципін түсінуге мүмкіндік берді. ДНҚ –ң тізбектері нуклеотидтерден тұрады. ДНҚ екі еселенгенде тізбектер екі жаққа бөлініп кетеді. Содан кейін ДНҚ-ң дуплексі пайда болады. Репликацияда ДНҚ комплементарлық тізбегі бөлінеді де, әр қайсысы жаңа комплементарлық тізбектің синтезіне матрица болып табылады. Екі бірдей ұрпақ пайда болады. Уотсон мен Крик моделінің айрықша ерекшелігі репликация проблемасын, тұқым қуалаушылықтың ерекше белгісін өте нәзік сипаттай білді. ДНҚ-ң қос тізбегінің әр бір тізбегі жаңа түілетін тізбекке арқау болып талылады да, әр бір ДНҚ-ның молекуласынан екі дәл сол аналық ДНҚ-дай молекула түзіледі. Жаңадан түзілген әр бір молекуланың бір тізбегі аналық ДНҚ тізбегінің бірі болып табылады. Сондықтан ДНҚ осындай жолмен синтезделуін жартылай концервативті жол деп атайды. Матрицалық комплементарлық көшіру ДНҚ-полимераза ферментінің көмегімен жүзге асады. ДНҚ полимераза ферменттері ДНҚ-ң синтезін бір тізбекті матрицада жүргізеді. Бірінші фермент 1956 ж. Е. соІі-ден табылған. ДНҚ тізбегінің фрагменті матрицаға комплментарлық –ұытқы бар болғанда ДНҚполимераза ДНҚ синтезін бір тізбекті матрицада жүргізеді.
ДНҚ-полимераза ұйытқыны өсіріп, нуклеотидті қосып толықтырады. Келесі нуклеотид ДНҚ-полимеразаның субстарты реакцияға активті, жоғары энергетикалық дезоксирибонуклеозидүшфосфат түрінде келеді. ДНҚ синтезі кезінде ұйытқының аяқ жағына нуклеотидтердің қосылуы байланыстың энергиялық гидролизбен және пирофосфаттың бөлініп шығуымен аяқталады. Ал дезоксирибонуклеозидмонофосфат ДНҚ тізбегінің фосфодиэфирлік байланыспен байланыстырады да, бір звеноға ұзарады.
2. Репликацияның негізгі принциптері. ДНҚ тізбегінің инициациясы. ДНҚ полимеразалар ДНҚ-ң жағһңа тізбегінің инициациялай алмайды. Олар тек бар ұйытқының құрылысын жалғастырып, аяқтай алады. Бұл қасиет ДНҚ синтезіне қойылатын жоғары дәлділік талабына байланысты. Жоғарыда айтылғандай, ДНҚ полимеразалардың қатесіз жұмысы белгілі бір дәрежеде олардың соңғы нуклеотиді матрицамен жұптастаған ұйытқыны ұзарта алмайтындығымен сипатталад. Бос нуклеотидтер матрицамен жұптаса алмайтындықтан, ДНҚ тіщбегінің ең бірінші нуклеотидінің келісімімен байланысуы матрицамен жұптаспаған ұйытқы соңына нуклеотидтің жалғасуына ұқсас және мүмкін емес. Жанадан синтезделген ДНҚ тізбегінің әрқашан 5/-соныңда бірнеше рибонуклеотидер болады. Басқаша айтқанда ДНҚ синтезі РНҚ синтезінен басталады. ДНҚ синтезі үшін РНҚ ұйытқыны ДНҚ праймаза деп аталатын арнайы фермент түзіледі. Праймаза бактерияларындағыдай жеке фермент ретінде немесе ДНҚ полимеразаның суббірлігі ретінде кездеседі. Екі жағдайда да праймаза түрлі жасушалық РНҚ синтездеуге қатысатын РНҚ полимеразалардан өзгеше және полинуклеотидтік тізбек синтезін инициациялауға қабілетті фермент. Эволюциялық жағынан праймазалар РНҚ полимеразалардан пайда болған. ДНҚ тізбегі синтезделе бастағаннан соң РНҚ затрауканың үзіп тастайды және түзілген тесікті жоғары дәлдікпен ДНҚ полимеразалар құрастырады.
Репликация кезінде ДНҚ қос спиралінің тарқатылуы. Табиғи ДНҚ қос спиральды: репликация алдын аналық молекула тізбегі-ДНҚ матрицалық тізбегі екіге ажырауы қажет. Бұл реакцияның екі типті ақуыз жүргізеді: хеликазалар және SSB-ақуыз. Хеликазалар деп ДНҚ-ның қос спиралін тарқату үшін АТФ гидролизі энергиясының қолданатын, ДНҚ тәуелді АТФ-азаны айтады. АТФ гидролизі көмегімен қозғалатын хеликаза алдындағы қос спиральды тарқата, ДНҚ-ның бір тізбегі бойымен бір бағытты жүреді. ДНҚ тізбегінің 5/соңынан 3/ соңына қарай және керісінше, 3/ соңынан / соңына қарай жүретін хеликазалар бар. Хелика жұмысының арқасында ДНҚ-ның қос спиральды аймағынан ренатурациясына олардың біржіпшелі ДНҚ мен таңдамалы ұқсас SSB-ақуызымен байланысуы қарсы тұрады.хеликазалар және SSB-ақуыздар көптеген про және эукариоттық ағзаларда табылған. SSB-ақуыз ақуыздың репликациядағы маңызы: ДНҚ дұрыстау, созу және ізіндік комплементарлы ДНҚ аймақтарында түзілуі мүмкін екіншілік құрылым элементтерін жою. Біртізбекті ДНҚ-ң SSB-ақуызымен байланысуы ДНҚ-полимеразаны стимулдайды және оның жұмысының дәлдігін жоғарылатады. Бұл әсер біртізбекті ДНҚ-ң екіншілік құрылымының бұзылуын, сонымен қатар, ДНҚ-полимеразалардың SSB-ақуыздармен әйтеуір өзара әсерлесуін реттейді. Өйткені, әдетте полимеразаны басқа көздің ұқсас ақуызы емес, тек «өзінің» SSB-ақуызы стимулдайды.
Е.соІі SSB-ақуызы-мөлшері 19 кД тең біркелкі суббірліктерден тұратын тетрамер. SSB-ақуызы ДНҚ-мен кооперативті байланысады, яғни ақуыз-ақуыздық өзара әсерлесу арқасында тетрамерлер ДНҚ-ны бір-біріне тығындап жауып жатады.
3. ДНҚ-ң үзілмелі синтезі. Дуплексте ДНҚ тізбегі антипараллельді болғандықтан, репликацияда қос спиральдың тарқатылунының бағыты ДНҚ синтезінің тек бір матрицалық тізбегінің бағытымен, бірақ комплементарлы матрица ДНҚ синтезі бағытына қарама-қарсы сәйкес келеді. Екінші матрицада ДНҚ салыстырмалы қысқа, Оказаки фрагменттері деп аталатын фрагменттер түрінде синтезделеді. Бастапқы молекуланың екі матрицалық тізбегінде ДНҚ синтезі айқас ажыратылады. Үзіліссіз синтезделетін жаңа синтезделген тізбек жетекші, ал екінші тізбек кешігуші аталады. әр бір Оказаки фрагменті 5/-соңында бірнеше, праймаза әсерінен түзілетін рибонуклеотидтер болады. Бактерия және эукариот Оказаки фрагменттерінің мөлшері түрліше сипатталады: бактерияларда олардың ұзындығы 1000 нуклеотидпен, ал эукариоттарда олар қысқа, 100 нуклеотидтермен сипатталады. Синтез соңынан біраз уақыттан кейін, РНҚ ұйытқылар үзіледі де, тесіктерді ДНҚ полимеразалар құрастырылады, ал фрагменттер арнайы ДНҚ-лигаза ферменттерінің көмегімен бір ковалентті-үзіліссіз ДНҚ тізбегіне тігіледі. ДНҚ лигазалар түрлі ағзаларда табылған. Олар жоғары энергетикалық кофакторларды қажет етеді.
4. Эукариоттарда репликация инициациясы. Эукариот геномы бактериялық геномнан үлкен, ал керісінше, эукариоттарда ДНҚ синтезінің жылдамдығы бактерия ДНҚ синтезі жылдамдығынан төмен. Осы себептен эукариот ДНҚ синтезінің инииациясы хромосоманың көптеген түрлі нүктелерінде жүреді. Яғни эукариот хромосомаларына полирепликондық ұйымдасу тән. Жоғары сатыдағы эукариоттардың репликон мөлшері шамамен 100000 полипептидтік қалдық. Ал төменгі сатыдағы эукариоттарда мысалы, ашытқылардың инициациясында кездейсоқ тізбекте емес атарлықтай анық репликация оринжинінде жүреді. Бұл бөліктер бір-біремен тізбегінің бір ізділігі жағынан түрліше, бірақ бірқатар гомологты бөліктері болады. Ол гомологты бөліктер ядролық ақуыздардың репликациясының инициациясына жауаптыларды тану орны қызметін атқарады. Жоғары сатыдағы эукариоттарда инициация айтарлықтай анықталған оринжинде жүру-жүрмеуі айқын емес. Бірақ эукариоттық вирустьарда инициация анықталған оринжиндерде жүреді.
Репликация инициациясы қатаң реттеледі. Полирепликондық ұйымдасу жасуша бөлінуінің әр бір циклінде әр бір оринжин бір-ақ рет жұмыс істуін талап етеді. Өйтпесе, хромосомада бұтақтанған құрылым пайда болады. Ашытқыларға тән ARS-біріздігі инициация жасуша циклінің ғана бір рет жүрелі. Жоғары сатыдағы эукариоттарда бірнеше көрші репликондардан құралған хромосомада ДНҚ синтезін S фазада шамамен бір уақыттта жүреді. Бірақ әрбір мұндай бөліктердің репликация инициациясының уақыты бар: біреуі S фазаның басында, екіншісі кейінірек, үшіншісі соңында белсендіріледі. Инициацияның қайталануына қойылған шектің бұзылуы өте сирек кездеседі. Ол хромосоманың сол бір бөлігінің амплификациясына әкеп соғады. Яғни ол жерде артық репликация инициациясы жүреді.
ДНҚ полимеразалардың жаңа тізбекті инициациялай алмауы және тек 3/ соңын ұзарта алатындығы, сызықтық ДНҚ-ның толық репликациясының тудыра алмайды. Репликацияның әрбір раундында сызықтық мокулалар қысқаруы қажет. Эукариот хромосомалары сызықты, сондықтан олардың соңы-тломері репликациясының арнайы механизмі РНҚ-нан бөлініп алынды. Бұл ағзалар хромосоманың соңында жай қайталанған бірізділік бар. Ядрода болатын фермент матрицасыз хромосомалық ДНҚ-ң 3/ соңына соңғы қайталану бір ізділігін жұмыс істейді. Сондықтан репликацияның әр бір раундында қысқарудың орнына хромосомалар шың мәнінде ұзарады. Хромосома соңында жай қайталанудың санын бақылау қалай жүретіні белгісіз. Бірақ хромосоманың шексіз өсуіне жол бермейтін механизмнің болатындығы белгілі. Трипоносомада хромосома соңы әр бір репликация раундында ұзарады. Бірақ белгілі бір мезетте оның қысөаруы жасуша циклі бұзылған мутант ашытқыда теломер ұзаруы байқалған. Соңғы мәліметтер жоғары сатыдағы жануарлар мен өсімдіктерде теломерлердің ұқсас ұйымдасуын көрсетті. Бактерия хромосомасының репликациясы ДНҚ толығымен еселенгенге дейін жүреді. Репликация бірлігі репликон деп аталады. Бактерия жасушасындағы әр бір ДНҚ молекуласының жеке репликоны болады. әр бір бактериялық репликон репликациясы, жиірек Е. соІі хромосомасының репликациясы репликация орилджин дп аталатын ДНҚ-ң белгілі-бір таңдалған айма,ынан басталады. Әр бір репликонның ориджині ДНҚ-ң айқын бірізділігінен тұрады. Раунд репликация инициациясы нәтижесінде ориджинде бір немесе екі репликациялық қос тіл пайда болады. Ориджиннің бір ізділігі ДНҚ-ға белсендіақуыздарды отырғызу аймағы қызметін атқарады және ДНҚ синтезінің басталуына әкелетін ДНҚ қос спиралінің тарқатылуына мүмкіндік туғызады.
Репликация Е.соІі де жақсы зерттелген. Бұл ағзада үш ДНҚ полимераза бар. Бұл үш фермент және олардың басқа бактериялардағы аналогтары корреляциялық экзонуклеазалық белсенділікке ие.
ДНҚ-полимераза І ұзындығы 911 аминқышқылдық қалдыққа тең бір полипептидтіктен тұрады. Бұл фермент басқа Е.соІі ДНҚ полимеразаларынан 5/экзонуклеазалық белсенділігінің болуымен ерекшеленеді. Іс жүзінде ДНҚ полимераза 1-бір полипептидтік тізбектегі екі фермент болады: органикалық протеолиз бұл ДНҚ полимеразаны белсенділігі әр түрлі үлкен және кіші фрагменттерге бөледі. ДНҚ полимераза І-дің үлкен субфрагменті полимеризациялау және 3/- экзонуклеазалық белсенділікке ие. Кіші субфрагмент 5/-экзонуклеазалық белсенділікке ие. ДНҚ-полимераза І-дің 5/-экзонуклеазасы тек дуплекс құрамында полинуклеотидтік тізбектің 5/ соңынан әсер етеді және одан моно-және олигонуклеотидтерді үзеді. 5/-экзонуклеаза әсерінің бағыты ДНҚ-ң жаңа тізбегінің полимеризациясы бағытымен сәйкес келеді. Яғни, полимеризация барысында экзонуклеаза полимеризация үшін жолды тазалайды. ДНҚ полимераза І-ң бұндай қасиеті жасушадағы оның қызметімен байланысты. Бұл полимераза репарация барысында ДНҚ-ң түрлі дефектілерін жояды және РНҚ-ұйытқыларды жойып, ДНҚ репликациясы кезінде қосымша полимераза қызметін атқарады.
ДНҚ-полимераза ІІ-М=120 000 D полимеризациялау және 2/ экзонуклеазалық белсенділікке ие полипептид. Бактерия жасушасында оның мөлшері ДНҚ полимераза І-н төмен. Бұл полимераза қос тізбекті ДНҚ-да жақсы жұмыс жасайды. Осының негізінде ДНҚ полимераза ІІ-ң ДНҚ репарациясына қатысатынын болжауға болады. Репарацияда үлкен суббірлікті фермент ДНҚ-полимераза ІІІ басты роль атқарады. Жасушада бұндай бірнеше ғана мультимерлер саны репликациялық қос тіл санына тең. ДНҚ полимераз ІІІ 7 типті суббірліктен тұрады және қосынды салмағы 500 кД шамасында болады. Ин витрода полимераздық белсенділікке суббірліктердің түрлі толық емес агрегаттары ие бірақ репликацияны ферменттің толық формасы құрамында барлық суббірліктер бар холофермент жүргізеді. Бірінші холоерментпен кешен түзеді, сосын блсендірілген холофермент матрица ұйытқымен байланысады да, АТФ АДФ және фосфатқа дейін гидрлиденеді. Осындай жолмен түзілген кешен іс-жүзінде шексіз синтез процестілігімен сипатталады. АТФ матрицаға байланысудың қайтымсыздығын қамтамасыз етеді. Элонгаяция үшін де АТФ қажет бірақ тек аллостерикалық эффектор ретінде ғана қажет. Аллостерикалық эффектор ДНҚ полимеразаның жасушаның етілген жағдайында ғана жүруіне мүмкіндік береді. Қолайлы жағдайда ДНҚ синтезінің жылдамдығы ДНҚ полимераза ІІІ холоферменті көмегімен шамамен репликация жылдамдығына сәйкес еекундына 1000 нуклеотидке тең.
Эукариотты ағзалар жасушаларынан төрт ДНҚ-полимеразалар таныған:α, β, γ, δ ядролық репликацияның негізгі ферменті болып табылады. Бұл ферменттің мөлшері ДНҚ синтезі белсенді жүретін жасуша циклінің S фазасында артады. Бірақ бұл ДНҚ полимераза эукариоттар ДНҚ синтезінің ингибиторы-афидиколинмен басылады. Фермент түрлі өлшемдегі суббірліктерден тұрады. ДНҚ полимераза αсуббірлігінің бірі- ДНҚ жаңа тізбегінің инициациясы үшін қажетті фермент-ДНҚ праймаза болып табылады. ДНҚ праймазаменг ассоциация түзу бактреиялардың ДНҚ-полимеразаларына тән емес.
ДНҚ-полимераза β- мөлшері 40 кД шамасындағы бір полипептидтен тұрады. Бұл ферменттің әсері процессивті емес. Ең жоғары белсенділігі қысқа тесікті қос тізбекті ДНҚ-да байқалады. Бұл полимеразаның негізгі ролі ДНҚ репарациясында байқалады деп ойлауға болады.
ДНҚ-полимераза γ молекулалық салмағы 50 кД шамасындағы бірнеше біркелкі суббірліктерден тұрады. Бұл митохондрия ДНҚ синтезіне қатысатын митохондриялық фермент. Ұқсас фермент сімдіктердің хлоропластарында да табылған.
ДНҚ-полимераза δ молекулалық салмағы шамамен 150 кД тең және біркелкі емес екі суббірліктен тұрады. Бұл ферментке 3/ экзонуклеазалық белсенділік тән. Оның ДНҚ синтезіндегі роліайқын емес. Төменгі сатыдағы эукариот-ашытқыларда екі ДНҚ-полимеразалар: І және ІІ табылған.
Жасушаның әрбір бөлінуінде ДНҚ-ң әр бір молекуласы еселенеді, яғни әрбір ориджинде дәлдікпен репликацияның бір инициациясы жүруі қажет. Бұл орындалмаған жағдайда репликондар біртіндеп жоғалуы немесе оның бақылаусыз жиналуы мүмкін. Бұндай ретсіздіктерді реттеуші жүйелер бақылайды және рпликация реттелуіне қатаң талаптар қойылған. Белгілі бір репликонның көшірмесінің орташа санынан екі жаққа ауытқуды сезінуі қажет жіне ориджин инициация жиілігін сәйкесінше өзгертіп отыруы қажет.
Бақылау сұрақтары
1. Репликация дегеніміз не?
2. Репликацияның негізгі принциптері қандай?
3. ДНҚ-ң үзілмелі синтезі қалай жүреді?
4. Қандай ДНҚ полирмеразалар білесің?
5. Репликация инициациясының реттелуі?
Әдебиеттер тізімі
1. Уотсон Д.Ж. Молекулярная биология гена.- М.: Мир, 1978
2. Молекулярная биология: Структура биосинтез нуклеиновых кислот. (под ред. Спирин А.С.).- М.: Высшая школа, 1990.
3. Молекулярная биология : Структура рибосом и биосинтез белка. (под ред. Спирин А.С.).- М.: Высшая школа, 1996.
4. Сингер М., Берг П. Гены и геномы . В 2-х томах. –М.: Мир, 1998.